因调控是生命科学研究的重要领域，深入了解基因间的相互作用及其调控机制对于揭示生物的发育、疾病发生机制至关重要。3C（Chromosome Conformation Capture）是一种重要的染色体构象捕获技术，它被广泛应用于研究基因组中染色体的三维结构和基因调控网络。通过3C技术，我们可以捕获并分析染色体上不同区域之间的物理相互作用，从而了解基因组的空间结构和基因调控的机制。
一、3C及其衍生技术的介绍
基于3C技术发展出了多种衍生技术，如4C-seq、5C、Hi-C、ChIA-PET等，这些技术在揭示基因组的三维结构和基因调控中发挥着重要作用。4C-seq和Hi-C作为两个重要的3C技术衍生方法，通过分析染色体的三维结构与基因间相互作用，为我们提供了更加全面和精细的基因调控信息。
3C 及其衍生技术
二、4C-seq技术介绍
4C-seq（Circular Chromosome Conformation Capture Sequencing）是在3C技术的基础上发展而来的中高通量测序技术，通过选择特定区域（增强子、沉默子、启动子、功能性SNP位点、基因编辑位点、差异甲基化区域、染色质开放区域）作为锚点（bait,viewpoint）捕获并测定其与整个基因组中其他片段之间的相互作用。
4C-seq实验原理
甲醛交联固定染色质构象、主限制性内切酶（RE1）酶切、连接、解交联、纯化后得到杂交片段（3C模板）
通过次限制性内切酶（RE2）对3C模板进行二轮酶切、连接后得到环化4C模板
使用两步法PCR建库，使用特殊设计的引物对环化产物进行反向PCR，进行第二轮PCR制备4C-seq文库，并进行NGS测序。
4C-seq实验原理图
三、4C-seq与其他技术的比较
- 3C-seq可以测得两个特定靶点的互作，实验相对简单。4C-seq可以测定一个靶点区域与整个基因组的互作，实验相对复杂。
- 对于不明确的靶点关系，3C-seq可能会受限。例如，增强子/沉默子的直接靶标不一定是最近的基因启动子。
- 在基因表达调控中，增强子/沉默子区域通常与多个靶基因的启动子区域相互作用形成调控簇，例如超级增强子。这种调控关系4C-seq可以更好的揭示。
2.与Hi-C相比
四、4C-seq应用范围
4C-seq可用于研究基因组组织的多个方面
- 识别调控性染色质环：通过4C-seq技术，可以确定基因座与调控元件（如增强子和启动子）之间的物理相互作用，揭示基因调控网络中的关键调控因子和机制。这些调控性染色质环对基因表达的调控起着重要作用。
- 识别结构性染色质环：4C-seq可以帮助识别结构性染色质环，如由cohesin和CTCF调控的TAD边界形成的染色质环。这些结构性染色质环在维持染色体三维结构和基因组稳定性方面起着重要作用。
- 4C-seq可以辅助HiC解析局部TAD结构并揭示顺式调控元件的调控范围。例如，解析neo-TAD的形成以及疾病中的增强子劫持现象。
- 揭示基因表达调控簇：通过对具有相似染色质特性的基因组区域进行聚类分析，可以揭示基因表达调控簇。例如，可以识别超级增强子，这些区域在基因表达调控中起着关键的作用。
综上所述，通过4C-seq可以揭示特定区域与整个基因组之间的空间相互作用，进一步了解基因调控网络、基因组结构和功能的变化，以及染色体异常对细胞和个体的影响。4C-seq在基因调控研究、基因组重塑研究、染色体断裂和重排研究以及疾病研究等领域具有广泛的应用价值。
Cova G et al. Combinatorial effects on gene expression at the Lbx1/Fgf8 locus resolve split-hand/foot malformation type 3. Nat Commun. 2023 Mar 17;14(1):1475.
SHFM3是一种与Lbx1/Fgf8位点重复相关的先天性肢体畸形疾病。通过在转基因小鼠中研究SHFM3相关重排对染色质结构和基因表达的影响，发现Lbx1/Fgf8位点包含两个相互作用的调控区域。重排导致染色质结构的重组，并在顶端外胚层嵴（AER）中以类似Fgf8的模式异常活化Lbx1和Btrc基因。这些发现揭示了SHFM3的分子机制，并为基因组重排导致基因异常表达和疾病提供了框架。
通过对SHFM3 Dup患者和健康人进行4C-seq实验，与健康对照相比，检测到含有AER增强子的FGF8所在的TAD 125kb区域与LBX1和BTRC基因之间的互作特异性增加。并且通过对Dup和Inv类型小鼠的cHiC virtual-4C进一步验证了该结论。
Luan J et al. CTCF blocks antisense transcription initiation at divergent promoters. Nat Struct Mol Biol. 2022 Nov
本文通过基因编辑、染色质构象研究、高分辨率转录图谱等方法，揭示了精准定位的CTCF直接抑制上游反义转录本（uasTrx）的启动来塑造转录过程，而这种抑制与其结构功能无关。
本文研究了CTCF对非编码转录本的影响，通过PRO-seq、CTCF ChIP-seq等实验发现CTCF耗竭后导致不同启动子的uasTrx表达广泛上调。为了验证这种效应是否与CTCF和cohesion形成的loop、TAD结构有关，通过基因组编辑技术分别删除TSS近端CBS（CTCF结合位点）、远端loop锚点后通过4C-seq验证了CTCF对近端uasTrx的抑制作用独立于其三维结构功能。
Huang Z et al. The corepressors GPS2 and SMRT control enhancer and silencer remodeling via eRNA transcription during inflammatory activation of macrophages. Mol Cell. 2021 Mar 4 本文通过研究小鼠Ccl2位点的染色质结构、组蛋白修饰、转录因子和共调节因子动态以及eRNA转录，解释了核心抑制因子在控制与炎症基因表达相关的增强子和沉默子重塑中的作用。 通过4C-seq分析了Ccl2位点3D染色质结构和增强子/沉默子-启动子互作，解析了LPS激活免疫、核心抑制因子GPS2和SMRT的耗竭诱导了增强子-启动子loop的形成。
Dos Santos M et al. A fast Myosin super enhancer dictates muscle fiber phenotype through competitive interactions with Myosin genes. Nat Commun. 2022 Feb 24
成人肌纤维的收缩特性是由其肌球蛋白重链亚型的含量决定的。本文通过Chip-seqsnATAC-seq在重组快速肌球蛋白基因位点鉴定了一个超级增强子，并通过4C-seq鉴定了活跃的快速肌球蛋白启动子-超级增强子loop结构。再通过CRISPR/Cas9编辑技术，证明了该超级增强子在控制快速肌球蛋白基因中的重要作用，并揭示了启动子对共享超级增强子的积极竞争。
4C-seq比较了股四头肌（Fast Quadriceps）和比目鱼肌（Slow Soleus）在Myh4和Myh2启动子与超级增强子互作的差异性，反应了不同类型肌球蛋白Myh基因家族表达的特异性。
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